Các phương pháp xét nghiệm Covid-19

[Đặng Yến]

Hiện, trên thế giới đang triển khai song song 2 phương pháp xét nghiệm xác định người dương tính SARS-CoV-2 là xét nghiệm tìm gen virus (phương pháp PCR) và xét nghiệm kháng thể (thường sử dụng để xét nghiệm nhanh). Về phương pháp xét nghiệm PCR, Bộ trưởng Bộ Y tế Nguyễn Thanh Long cho biết, thời gian đầu chúng ta sử dụng nguồn sinh phẩm từ nước ngoài. Sau đó, Việt Nam đã phát triển được loại sinh phẩm xét nghiệm PCR rất tốt thay thế nguồn nhập khẩu. Sinh phẩm này đã và đang được sử dụng chủ đạo tại Việt Nam để xét nghiệm phát hiện virus SARS-CoV-2.
Bên cạnh đó, từ cuối tháng 3, Bộ Y tế đã cho rà soát lại toàn bộ hệ thống máy móc xét nghiệm bằng phương pháp PCR sẵn có tại doanh nghiệp để huy động, không cần trang bị thêm.

Phương pháp Realtime - PCR
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) (tiếng Anh: Polymerase Chain Reaction), cũng có nơi gọi là phản ứng khuếch đại gen hay phản ứng chuỗi trùng hợp, là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gen, và xác định huyết thống. Hiện nay, đây là phương pháp xét nghiệm cho kết quả chính xác và đáng tin cậy nhất, tuy nhiên lại tốn nhiều thời gian. Để lấy được kết quả xét nghiệm, người bệnh thường phải chờ 2 đến 3 ngày.
Nguyên tắc của PCR
Phương pháp PCR dựa trên chu kỳ nhiệt,nghĩa là các chu kỳ tăng giảm nhiệt độ trong phản ứng biến tính DNA và tái bản DNA. Đoạn mồi (là đoạn DNA ngắn) mang các trình tự bổ sung với trình tự DNA mẫu và DNA polymerase là những thành phần quan trọng cho phép khuếch đại một cách chọn lọc và lặp lại. Khi quá trình PCR diễn ra, DNA mới được tạo ra từ DNA khuôn ban đầu sẽ tiếp tục được sử dụng làm khuôn để tổng hợp phân tử DNA tiếp theo, tạo thành chuỗi phản ứng dây chuyền khuếch đại theo cấp số nhân.
Một quá trình PCR được thực hiện thông qua 3 bước chính là biến tính, ủ và mở rộng. Ba giai đoạn này được lặp lại 20-40 lần, gấp đôi số lượng bản sao DNA mỗi lần.

Ở bước đầu tiên, hai sợi xoắn kép của DNA biến tính tách ra ở nhiệt độ cao. Ở bước thứ hai, nhiệt độ được hạ xuống và hai sợi DNA trở thành khuôn cho DNA polymerase tổng hợp đoạn DNA đích. Khả năng khuếch đại chọn lọc là do việc sử dụng mồi mang trình tự bổ sung với đoạn ADN đích khuếch đại dưới những chu trình nhiệt đặc hiệu. Và quá trình đó được mô phỏng chi tiết dưới đây

Giai đoạn biến tính

• Trong giai đoạn này, dung dịch chứa DNA mẫu và tất cả các thành phần cốt lõi khác được đun nóng đến 94-95⁰C.
• Đối với những enzyme DNA polymerase bắt buộc phải kích hoạt bằng nhiệt độ
• Nhiệt độ cao gây ra liên kết hydro giữa các bazơ trong hai dải DNA mẫu để phá vỡ và hai sợi tách rời. Điều này dẫn đến hai chuỗi DNA đơn lẻ, sẽ hoạt động như các khuôn mẫu để tạo ra các chuỗi DNA mới.
• Điều quan trọng là nhiệt độ được duy trì ở giai đoạn này đủ lâu để đảm bảo rằng các sợi DNA đã tách hoàn toàn.
• Điều này thường mất từ 15-30 giây.

Giai đoạn ủ

• Nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50-65°C trong 20-40 giây để mồi gắn vào sợi DNA đơn. Nhiệt độ này cần phải đủ thấp để cho phép mồi bắt cặp với sợi DNA, nhưng cũng đủ cao cho quá trình bắt cặp đặc hiệu, nghĩa là mồi chỉ nên gắn hoàn toàn với phần trình tự bổ sung trên mạch khuôn. Nếu nhiệt độ quá thấp, mồi sẽ gắn không đặc hiệu. Nếu quá cao, mồi có thể không gắn được. Thông thường nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn 3-5 °C so với Tm của mồi dùng trong phản ứng. Polymerase liên kết với các phân tử lai DNA mồi – khuôn và bắt đầu tổng hợp DNA.
• Các đoạn mồi được thiết kế để bổ sung theo thứ tự các đoạn ngắn của DNA trên mỗi đầu của chuỗi được sao chép.
• Đoạn mồi được xem là tác nhân đầu tiên trong quá trình tổng hợp DNA. Enzyme polymerase chỉ có thể thêm các base DNA vào một chuỗi DNA kép. Chỉ một khi đoạn mồi được kế nối thì enzyme polymerase có thể gắn và bắt đầu tạo ra chuỗi DNA bổ sung mới từ các cơ sở DNA có liên kết rời rạc lúc đầu.
• Hai dải DNA tách rời được bổ sung và chạy theo các hướng ngược.
• Bước này thường mất khoảng 10-30 giây.

Giai đoạn mở rộng

• Trong bước cuối cùng này, nhiệt được tăng lên 72⁰C để cho phép DNA mới được tạo ra bởi một enzyme enzyme Taq DNA polymerase đặc biệt bổ sung thêm các base DNA.
• Các chuỗi ADN mới được tạo ra bằng cách sử dụng các sợi gốc làm mẫu. Một enzyme DNA polymerase kết hợp các nucleotide DNA tự do với nhau. Enzyme này thường là Taq polymerase, một enzyme ban đầu được phân lập từ một vi khuẩn ưa nhiệt gọi là Thermus aquaticus.
• Thứ tự mà trong đó các nucleotide tự do được thêm vào được xác định bởi trình tự nucleotide trong sợi DNA gốc (mẫu).
• Kết quả của một chu kỳ PCR là hai chuỗi chuỗi DNA mục tiêu, mỗi chuỗi chứa một sợi mới được tạo ra và một sợi ban đầu.

Phương pháp xét nghiệm tìm kháng thể (thường dùng trong test nhanh)
Phương pháp này được ứng dụng trong kỹ thuật xét nghiệm bằng que thử nhanh, dùng để sàng lọc ban đầu. Ưu điểm của phương pháp này đó là quy trình đơn giản, nhanh có được kết quả, tuy nhiên độ chính xác không cao vậy nên để khẳng định chẩn đoán vẫn cần thực hiện PCR.

Nguyên tắc của test nhanh
Với loại test phát hiện kháng nguyên A hoặc kháng thể kháng B hoặc cả kháng nguyên A và kháng thể kháng B: Lớp màng được phủ sẵn các kháng thể kháng A hoặc kháng nguyên B hoặc cả hai tại 2 vị trí khác nhau trên vùng kết quả của test thử. Trong quá trình xét nghiệm, hỗn hợp mẫu bệnh phẩm di chuyển lên kiểu sắc ký trên bề mặt màng nhờ hiện tượng mao dẫn để phản ứng với các kháng thể kháng A hoặc kháng nguyên B đã gắn trên màng và tạo ra vạch màu. Sự xuất hiện vạch màu chứng tỏ có sự hiện diện của kháng nguyên A hoặc kháng thể kháng B hoặc cả kháng nguyên A và kháng thể kháng B (khi có 2 vạch màu) trong mẫu bệnh phẩm.
Để làm đối chứng theo quy trình, một vạch màu sẽ luôn xuất hiện trong vùng chứng.

Nguồn: Tổng hợp
Có thể bạn muốn tìm hiểu thêm: Giáo trình sinh học phân tử